By Gunter Mertes, Thomas Schafer, Thomas A. Schild, Gerald Schmidt, Dagmar Schuster, Jorg vom Stein
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Preimplantation Genetic Diagnosis
Preimplantation genetic analysis (PGD) is a key strategy in glossy reproductive drugs. initially built to assist who have been susceptible to transmitting single-gene genetic abnormalities to their young ones, the advance of the FISH strategy broadened chromosome research to incorporate detection of extra complicated inherited abnormalities.
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2 Die DNA-Praparation fur die automatische DNA-Analyse 11 1mM Tris (pH 8,5) zur direkten Verwendung in der automatischen Taq-Zyklussequenzierung. Die DNA-Konzentrationen im Eluat liegen bei 150-200 ng/ p1. Samtliche Aufreinigungsschritte lassen sich in einer Vakuumkammer (QIAvac) durchfuhren. Zum einen wird der Flurj der Losungen durch die verschiedenen Membranen erleichtert, zum anderen wird aber auch der direkte Transfer der Losungen von einer Einheit zur nachsten garantiert. Bis zu 96 Proben konnen parallel bearbeitet werden (96-well plate).
Zu diesem Zweck wird in den Ansatzen das Nukleotid dTTP durch dUTP ersetzt. Die Amplifikate enthalten dadurch Uracil. Uracilhaltige Nukleinsauren sind jedoch das Substrat von UNG. Setzt man nachfolgende PCR-Ansatze vor der Amplifikation einem UNG-Verdau aus, so wird Uracil aus moglicherweise verschleppten Amplifikaten aus vorrangegangenen Amplifikationen entfernt, wahrend die DNA-Matrizen, die Thymidin als Base enthalten, nicht angegriffen werden. Die Vorbehandlung der PCR-Ansatze wird durch eine Inkubation bei 95 "C abgeschlossen, durch die UNG deaktiviert und die nun abasischen Verschleppungskontaminationen zerstort werden.
Diese inhibierende Wirkung kann jedoch durch Zusatz nichtionischer Detergenzien (z. B. 0,5% Tween 20) aufgehoben werden. 2 Optimierungsstrategien Im folgenden sollen diese verschiedenen Parameter zu einer moglichst effizienten PCR-Optimierungsstrategie zusammengestellt werden: 0 0 0 Auswahl eines Primer-Paares nach den oben beschriebenen Parametern. Berechnung des ungefahren T,. Programmierung des Thermocyclers unter Berucksichtigung der Leistungswerte des verwendeten Thermocyclers sowie des eingesetzten Enzyms.